Embriotransfer – presajanje zarodkov pri kravah

Konvencionalni prenos zarodkov
Ker povprečen bik v čredi vsako leto priredi 20-30 telet, povprečna krava pa eno tele na leto, je genetski napredek z naravno vzrejo postopen proces. Vendar je pojav umetnih osemenitev pospešil hitrost genetskega napredka z razširjanjem genetike vrhunskih bikov. Čeprav je umetna osemenitev omogočila velik genetski napredek, je polovica genetskega potenciala telet ostala v glavnem neizboljšana, dokler ni skoraj 40 let pozneje postal komercialno dostopen prenos zarodkov (embriotransfer - ET). Konvencionalni ET omogoča izkoriščanje materinske genetike na podoben način kot umetna osemenitev, ki širi očetovsko genetiko. Dragocena krava, ki bi prej vzredila le eno tele na leto, lahko zdaj s tehnologijo ET potencialno vzredi 50 ali več telet na leto.

Razumevanje konvencionalnega postopka ET

Splošni cilj konvencionalne ET je ustvariti številne vitalne zarodke iz genetsko superiornih krav donork in plemenjakov za prenos v krave prejemnice (ali nadomestne krave). To se doseže s superovulacijo in osemenitvijo izbranega donorja, izpiranjem donorja za pridobivanje nastalih zarodkov in nato prenosom zarodkov v krave prejemnice ali zamrznitvijo zarodkov za prenos ob drugem času.

Superovulacija darovalke/osemenitev

V normalnem ciklusu krava običajno proizvede le eno jajčece, ki se, če je oplojeno, razvije v en sam zarodek. Da bi ustvarili več zarodkov za ET, moramo najprej pridobiti več jajčnih celic. To dosežemo s superovulacijo darovalke. Darovalki apliciramo folikle stimulirajoč hormon (FSH) za spodbujanje rasti foliklov. Tretji dan zdravljenja s FSH dobi darovalka tudi injekcijo prostaglandina F2α (PGF2α). To privede darovalko do estrusa (ali gonitve) v naslednjih 24 do 48 urah. Darovalko nato oplodimo z umetno osemenitvijo 14 in 20 ur ali 12, 18 in 24 ur po estrusu.

Spiranje zarodkov

Oplojenim jajčecem, ki se zdaj imenujejo zarodki, se omogoči, da se sedem dni razvijajo v maternici darovalke. Nato se zarodki z nekirurškim odvzemom sperejo iz maternice. Veterinar darovalki najprej uvede epiduralno anestezijo, ki sprosti križne živce in prepreči, da bi se krava med postopkom napenjala. Nato rektalno otipa reproduktivni trakt in v maternico uvede silikonski kateter. Manšeta katetra se napihne, da se zapre odprtina materničnega vratu in prepreči, da bi zarodki stekli mimo katetra in iz maternice. Na zunanji konec katetra je priključen Y-povezovalnik z dovodnimi in odvodnimi cevkami. Skozi dovodno cevko se v maternico spusti posebej zasnovan medij za izpiranje. Tekočina nato gravitacijsko odteče iz maternice skozi odtočno cevko. Odtočna cev je povezana s filtrom, ki zbira zarodke, ko tekočina prehaja skozi. Tekočino za izpiranje večkrat dodamo v maternico in jo iz nje odvzamemo, da se zarodki izperejo iz maternice v filter.

Ko je izpiranje končano, se zarodki sperejo iz filtra in pod mikroskopom ocenijo glede na njihovo kakovost in stopnjo razvoja. Zarodki se nato pripravijo za svežo presaditev v krave prejemnice (katerih gonitveni cikli so bili sinhronizirani tako, da se ujemajo s cikli darovalke) ali za zamrznitev za kasnejšo presaditev.

Prenos svežih zarodkov

Z mikroskopom se vsak zarodek posebej napolni z gojiščem v slamico s prostornino ¼ kubičnega centimetra. Vsaka slamica se nato vstavi v aplikator zarodkov, da se olajša prenos. Veterinar rektalno otipa jajčnike prejemnice, da ugotovi strukturo na jajčniku, znano kot rumeno telesce (CL). CL označuje, kateri jajčnik je imel ovulacijo. Veterinar vodi  ET aplikator v maternični rog na isti strani kot je jajčnik z aktivnim CL. Zarodek se iz pištole nežno iztisne v maternični rog, pri čemer je treba zelo paziti, da ne poškodujemo sluznice maternice, kar bi lahko bistveno zmanjšalo verjetnost uspešne brejosti. Če CL ni zaznana (ali je šibka), je prejemnica izpuščena in zarodka ne bo prejela, saj njeno maternično okolje ni primerno za vzpostavitev in vzdrževanje brejosti.

Zamrzovanje zarodkov

Če zarodkov ne boste presadili takoj, jih lahko zamrznete za poznejšo uporabo. Za zamrzovanje zarodkov se lahko uporabljajo različne metode, vendar je zaradi enostavnosti in praktičnosti uporabe na terenu pogosto najprimernejša metoda neposrednega prenosa (DT). Pred zamrzovanjem se zarodki pripravijo in posamično naložijo v ¼ cm3 slamic z uporabo zamrzovalnega medija, ki vsebuje etilen glikol. Medij, ki obdaja zarodke, se nato posuje z ledenimi kristali, slamice pa se v zamrzovalniku za zarodke počasi ohladijo na -35 °C. Zarodki se nato potopijo v tekoči dušik, kjer se lahko hranijo več let, dokler se ne odtalijo za prenos.

Neposredni prenos zamrznjenih zarodkov

Pri zarodkih, zamrznjenih z metodo DT, je odtajanje za prenos preprost postopek. Slamico z zarodkom odstranimo iz posode s tekočim dušikom in pustimo, da se nekaj sekund odtaja na zraku, nato pa jo za 15 sekund postavimo v vodno kopel s temperaturo 31 °C. Slamica z zarodkom se vstavi v ET aplikator in odmrznjeni zarodek se prenese na popolnoma enak način kot prenos svežega zarodka v prejemnico.

POMEMBNA PRIPOROČILA ZA KONVENCIONALNI ET

Proizvodnja zarodkov

Rezultati spiranja se razlikujejo od krave do krave in so odvisni od številnih dejavnikov, med drugim od starosti, pasme, zdravstvenega stanja in prehranske oskrbe krave ter kakovosti semena in učinkov ponavljajoče se superovulacije. Na splošno je povprečno število prenosljivih zarodkov, pridobljenih na odvzem, od šest do sedem, čeprav lahko to število zelo niha od nič do 50 ali več sposobnih zarodkov. Nekatere krave morda niso primerne darovalke za konvencionalni ET zaradi fizičnih brazgotin ali nepravilnosti reproduktivnega trakta, ki preprečujejo proizvodnjo ali zbiranje zarodkov. Darovalke se lahko spere vsakih 45 do 60 dni; vendar se lahko proizvodnja sčasoma zmanjša, če se krave zaradi ponavljajoče se superovulacije nenehno spirajo. V tem primeru je koristno, da se darovalka oplodi in se ji omogoči telitev, preden se nadaljuje z spiranjem.

Stopnje brejosti

Pri sveže presajenih zarodkih lahko v dobro vodenih čredah prejemnic pričakujemo 60-80-odstotno stopnjo brejosti. Ker se med postopkom zamrzovanja in odmrzovanja zarodki nekoliko poškodujejo, je stopnja brejosti pri zamrznjenih odmrznjenih zarodkih običajno za približno 10-15 % nižja kot pri sveže prenesenih zarodkih.

Uporaba semena

Ker  v približno 24 urah ovulira večja količina jajčnih celic od običajne, je za osemenitev krav darovalk običajno potrebna večja količina semena v primerjavi z vzrejo z umetno oploditvijo ali oploditvijo jajčnih celic in vitro. Na splošno se pri vsaki od dveh ali treh osemenitev uporabi ena do tri slamice semena. Ob prvi osemenitvi se oceni kakovost semena in ustrezno prilagodi skupna količina uporabljenega semena. Za bolj kakovostno seme bo pri vsaki osemenitvi potrebnih manj slamic, za manj kakovostno seme pa več slamic.